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到了三级文明,有关克隆,已经研究到了分子水平,也就是分子克隆!
什么是分子克隆呢?
在分子水平上提供一种纯化和扩增特定dna片段的方法。常含有目的基因,用体外重组方法将它们插入克隆载体,形成重组克隆载体,通过转化与转导的方式,引入适合的寄主体内得到复制与扩增,然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体,可以得到插入dna的许多拷贝,从而获得目的基因的扩增。
分子克隆是指分离一个已知dna序列,并以in vivo(活体内)方式获得许多复制品的过程。这一复制过程经常被用于增加并获取dna片段中的基因,但也可用来增加某些任意的dna序列,如启动子、非编码序列、化学合成的寡核苷酸或是随机的dna片断。
将dna片段(或基因)与载体dna分子共价连接,然后引入寄主细胞,再筛选获得重组的克隆,按克隆的目的可分为dna和cdna克隆两类。
cdna克隆是以mrna为原材料,经体外反转录合成互补的dna(cdna),再与载体dna分子连接引入寄主细胞。每一cdna反映一种a克隆的分布也反映了mrna的分布。特点是:
有些生物,如rna病毒没有dna,只能用cdna克隆;
cdna克隆易筛选。因为cdna库中不包含非结构基因的克隆,而且每一cdna克隆只含一个mrna的信息;
cdna能在细菌中表达。cdna仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息,只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。
那么。如何做到这一点呢?
首先是dna片段的制备!
常用以下方法获得dna片段:1用限制性核酸内切酶将高分子量dna切成一定大小的dna片段;2用物理方法(如超声波)取得dna随机片段;3在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下,用人工方法合成对应的基因片段;4从a。
其次是载体dna的选择,这里要知道,什么是质粒。
质粒是细菌染色体外遗传因子,dna呈环状,大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在,很容易制备。质粒dna可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态。一是‘紧密型‘;二是‘松弛型‘。此外还应具有分子量小,易转化,有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的dna片段。适用于构建原核生物基因文库,cdna库和次级克隆。
柯斯(cos)质粒是一类带有噬菌体dna粘性末端顺序的质粒dna分子。是噬菌体-质粒混合物。此类载体分子容量大,可携带45kb的外源dna片段。也能象一般质粒一样携带小片段dna,直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。
而噬菌体dna。常用的λ噬菌体的dna是双链。长约49kb,约含50个基因,其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的,分布在噬菌体dna两端。中间是非必需区,进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cdna库。
m13噬菌体是一种独特的载体系统,它只能侵袭具有f基因的大肠杆菌,但不裂解寄主菌。m13dna(rf)在寄主菌内是双链环状分子,象质粒一样自主复制。制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链dna的m13噬菌体,又能方便地制备单链dna。用于dna顺序分析、定点突变和核酸杂交。
接着是dna载体的连接。
dna分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一,方法有:1粘性末端连接,dna片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端,用同一种限制性内切酶消化dna可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样,有些限制性内切酶虽然识别不同顺序,却能产生相同末端。2平头末端连接,用物理方法制备的dna往往是平头末端,有些酶也可产生平头末端。平头dna片段可在某些dna连接酶作用下连接起来,但连接效率不如粘性末端高;3同聚寡核苷酸末端连接。4人工接头分子连接,在平头dna片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段,经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。
连接反应需注意载体dna与dna片段的比率。以λ或cos质粒为载体时,形成线性多连体dna分子,载体与dna片段的比率高些为佳。以质粒为载体时,形成环状分子,比率常为1∶1。
最后是引入寄主细胞。
常用两种方法:1转化或转染,方法是将重组质粒dna或噬菌体dna(m13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上,待dna被吸收后铺在平板培养基上,再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子,通常重组分子的转化效率比非重组dna低,原因是连接效率不高,有许多dna分子无转化能力,而且重组后的dna分子比原载体dna分子大,转化困难。2转导,病毒类侵染宿主菌的过程称为转导,一般转导的效率比转化高。
此时的李安,操控着墨莲人。不断的收集材料,进行着研究。
三级文明,分子克隆有很多的作用!
分子克隆技术是发展起来的不久。它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域,打开了人类了解、识别、分离和改造基因,创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响,并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。
利用分子克隆技术已将胰岛素,人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松弛素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌,利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。
通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性,例如sv40病毒引起的小鼠肿瘤细胞。在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症,用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞,发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平。并确实能代谢半乳糖。
通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性,例如sv40病毒引起的小鼠肿瘤细胞,在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症,用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞。发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平。并确实能代谢半乳糖。
植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。有许多外源基因导入植物获得成功。
一个有关于李安的躯体正在不断的形成......
“这是一个多顺反子,在这里,在这里!为了自己的身体变得完美!”
既然是建造自己的身体,李安尽量让自己变得完美。
在原核细胞中,通常是几种不同的mrna连在一起,相互之间由一段短的不编码蛋白质的间隔序列所隔开,这种mrna叫做多顺反子mrna。顺反子的概念来自遗传学中的顺反重组试验,是确定交换片段究竟在一个基因内还是属于两个基因的试验。简言之,一个顺反子就是一个基因。多顺反子就是多个基因。真核生物中也有多顺反子,比如c.elegans共有13500个基因,约25%的是多顺反子。
mrna存在于原核和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器(如线粒体和叶绿体)中。rna病毒和rna噬菌体中的rna既是遗传信息的载体又具有mrna的功能。生物体mrna种类的多少与生物进化水平有关,高等生物所含的遗传信息多,mrna的种类也多。生物体内某种mrna的含量根据需要而有不同,如5龄蚕后部丝腺体的主要任务是快速合成大量丝心蛋白,因而编码丝心蛋白的mrna含量特别多。有些细菌需要不断多顺反子适应外部环境,其体内编码某些诱导酶的mrna的含量也较多。
原核和真核生物mrna有不同的特点:1原核生物mrna常以多顺反子(见)的形式存在,即一条mrna链编码几种功能相关联的蛋白质。真核生物mrna一般以单顺反子的形式存在,即一种mrna只编码一种蛋白质。2原核生物mrna的转录与翻译一般是偶联的,即转录尚未完毕,蛋白质的转译合成就已开始。真核生物转录的mrna前体则需经后加工,加工为成熟的mrna与蛋白质结合生成信息体后才开始,工作信息体中蛋白质与rna之比约为3。3原核生物mrna半寿期很短,一般为几分钟,最长只有数小时(rna噬菌体中的rna除外)。真核生物mrna的半寿期较长,如胚胎中的mrna可达数日。4原核与真核生物mrna的结构特点也不同。
一级结构与功能的关系:原核生物mrna一般5端有一段不翻译区,称前导顺序,3端有一段不翻译区,中间是蛋白质的编码区,一般编码几种蛋白质。如大肠杆菌乳糖操纵子mrna编码3条多肽链;色氨酸操纵子mrna编码5条多肽链。也有单顺反子形式的细菌mrna,如大肠杆菌脂蛋白mrna。原核生物mrna分子中一般没有修饰核苷酸,也没有5端帽子结构和3端聚腺苷酸尾巴。在原核生物mrna的起始密码子(aug)附近(5方向上游)的一小段长短不等的顺序,含有较多的嘌呤核苷酸,被称为sd顺序。(未完待续。。)